Η γόνιδιακη θέραπεια στοχέυει στη μέταφορα θεραπευτικών γονιδίων στα ανθρώπινα σωματικά κύτταρα με σκοπο την ίαση ασθενειών.Αρχικά η γονιδιακή θεραπεία απευθυνόταν σε κληρονομικές ασθένειες αλλά γρήγορα βρήκε εφαρμογή στον καρκίνο,στις μολυσματίκες ασθένειες,σε εκφυλιστίκες διαταραχές,κυρίως αυτές του νευρικού συστήματος(π.χ.Parkinson)κ.ά.
Παρόλο που η μεταφορά γονιδίων έχει εφαρμοστεί σε πολλές κλινικές δοκιμές,με πάνω από τριακόσιες να συνεχίζονται παγκόσμια αυτή τη στιγμή,δεν έχει τεκμηριωθεί επιστημονικά κανένα πλεονέκτημα για τον ασθενή.Όμως,οι προοπτικές για τη γονιδιακή θεραπεία παραμένουν υψηλές και οι ελπίδες για μελλοντική κλινική επιτυχία της μεθόδου να αυξάνονται μαζί με τη διέυρυνση του επιστημονικού αυτού
πεδίου.
H ανάπτυξη καλύτερων συστημάτων υποδοχής ειδικά διαμορφωμένα για τις διάφορες ασθένειες με τη συντηρούμενη έκφραση του \των θεραπευτικών γονιδίων στα κατάλληλα κύτταρα θα κατορθώσει στο τέλος να κάνει εφικτές τις θεραπευτικές ιδιότητες της γονιδιακής μεταφοράς.
1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η εφαρμογή γονιδιακής θεραπείας έγινε για πρώτη φορά για την αντιμετώπιση κληρονομικών διαταραχών,όπου το σωστό γονίδιο υποβοηθά την μή υπάρχουσα ή αλλοιωμένη λειτουργία.
Η πρώτη κλινική εφαρμογή της μεθόδου πραγματοποιήθηκε το 1990, οπότε ένας ασθενής με σοβαρή ανοσολογική ανεπάρκεια(σύνδρομο SCID) υποβλήθηκε σε μεταφορά περιφερειακών Τ λεμφοκυττάρων που μετέφεραν το γονίδιο της αδενοσινο-διακινάσης (adenosine deaminase) (ADA).Test που γίνανε 3 χρόνια αργότερα δείχνουν ότι περισσότερο από το 30% των Τ λεμφοκυττάρων του ασθενούς περιείχαν το μεταφερθέν γονίδιο με αποτέλεσμα τη σημαντική βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος.Αυτή η περίπτωση είναι η πρώτη τεκμηριωμένη γονιδιακή μεταφορά που είχε ευεργετικά αποτελέσματα για τον ασθενή.Ένας δέυτερος ασθενής που αντιμετωπίσθηκε σύμφωνα με την πρώτη αγωγή ένα χρόνο αργότερα έδειξε ανασυγκρότηση του ανοσοποιητικού και μόνο το 1% των Τ κυττάρων μεταφέρονταν στον ασθενή 3 χρόνια μετά τη θεραπεία.
Και οι 2 ασθενείς ,υποβλήθηκαν επίσης σε εξογενή διαχείρηση της ΑDA καθ’όλη τη διάρκεια της θεραπείας.Η πρώτη κλινική δοκιμή είναι χαρακτηριστική των προβλημάτων που πρέπει να αντιμετωπίσει η γονιδιάκη θεραπεία:
- Tην ανάγκη της αύξησης του αριθμού των κυττάρων στόχων που μπορούν αναπαραγωγικά να μεταφερθούν με το θεραπευτικό γονίδιο.
- Την ανάγκη να αποκτηθούν από τα κατάλληλα κύτταρα ένα ποσό προιόντων αρκετό για να ανακουφίσουν τα συμπτώματα της ασθένειας.
Ένα παράδειγμα όπου η περιορισμένη μεταφορά μπορεί να καταστεί θεραπευτική είναι η περίπτωση της αιμοφυλίας-Β, αρώστειας που προκαλείται από δυσλειτουργία της πρωτείνης πηξης του αίματος που καλείται παράγοντας ΙΧ. 5% του φυσιολογικού επιπέδου της πρωτείνης έχει αποδειχτεί αρκετό για να βελτιώσει την ποιότητα ζωής των ασθενών.
Ο παράγων ΙΧ παράγεται από τα υπατοκύτταρα τα οποία δε μπορούν να μεταφέρθουν με τους φορείς κυττάρων των πιο γνωστών κλινικών εφαρμογών.Ευτυχώς όμως «εργοστάσιο» παραγωγής ΙΧ μπορεί να στηθεί οπουδήποτε αλλού στο σώμα και όχι μόνο στο ήπαρ με την προυπόθεση ότι τα μεταφερθέντα κύτταρα θα μπορούν να διοχετεύουνικανοποιητική ποσότητα πρωτείνης στη ροή του αίματος.
Όμως άλλες ασθένειες δεν παρουσιάζουν τέτοια περιθώρια και απαιτούν τα θεραπευτικά γονίδια να δράσουν απευθείας στο προσβεβλημένο ιστό ή όργανο.Αυτή είναι για παράδειγμα η περίπτωση της Cystic Fibrosis (CF) (κυστική ίνωση) μιας θανατηφόρου ασθένειας που προκαλείται απο την έλλειψη του διαμεμεμβρανικού ρυθμιστή αγωγιμότητας(CFTR) που επιτρέπει στα κύτταρα του επιθυλίου του πνεύμονα να επεξεργάζεται τα ιόντα του χλωρίου.Το λειτουργικό CFTR γονίδιο θα πρέπει να μεταφερθεί στη μεγάλη πλειοψηφία των κυττάρων αυτών για να εκφραστεί το γονίδιο.Η γονιδιακή θεραπεία ασθενών CF έχει επικεντρωθεί πρωτίστως σε φορείς που μπορούν να`διαπερνούν μη διαιρούμενα κύτταρα και δείχνουν ένα φυσικότροπισμό για τους πνεύμονες.Δυστυχώς , τα αποτελέσματα είναι αρνητικά εξαιτίας της ισχυρής αντίδρασης του ανοσοποιητικού συστήματος στους χρησιμοποιούμενους φορείς.
Συμπερασματικά ,οι κύριοι περιορισμοί που επηρεάζουν την επιτυχία της γονιδιακής θεραπείας κληρονομικών ασθενειών είναι η χαμηλή αποτελεσματικότητα της μεταφοράς ,η χαμηλή επιτυχία προσβολής των επιθυμητών κυττάρων και η ανεπιθύμητη αντίδραση του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος.
Aρώστειες σχετιζόμενες με επίκτητη γενετική αλλαγή,όπως καρκίνος και μεταδιδόμενες ασθένειες, που έχουν πολύ μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης στον πληθυσμό έχουν συμπεριληφθεί στον κατάλογο των ασθενειών που μπορούν να αντιμετώπισθούν με γονιδιακή θεραπεία,και πολλές στρατηγικές προσεγγίσεις έχουν επινοήθει για το σκοπό αυτό.Η αρχική προσέγγιση που βασιζόταν στη « διάσωση» μιας μη υγιούς λειτουργίας με τη χορήγηση του λειτουργικού γονιδίου , έχει εξελιχθεί ώστε να περιλαμβάνει τα ακόλουθα:
- Τη διοχέτευση γονιδίων ικανά να σκοτώσουν το κύτταρο-στόχο σε ελεγχόμενες συνθήκες.
- Τη διοχέτευση ουσιών όπως αντιευαισθητοποιητικών μορίων και ριβενζύμων(ένζυμα από RNA) ικανών να απενεργοποιήσουν ένα λειτουργικό γονίδιο.
- Τη διοχέτευση ανοσοποιητικών παραγόντων ικανών να διεγείρουν το ανοσοποιητικό σύστημα, έτσι ώστε να καταστρέψει κύτταρα που ικανοποιούν ορισμένες προυποθέσεις.
Πολλές διαφορετικές προσεγγίσεις έχουν επινοηθεί για τη θεραπεία γενετικά επίκτητων ασθενειών,αντιμετωπίζοντας ορισμένα προβλήματα που έχουν ήδη περιγραφεί στην περίπτωση των κληρονομικών ασθενειών. Για παράδειγμα ,εξειδικευμένη «στόχευση»είναι απαραίτητη στην περίπτωση του καρκίνου έτσι ώστε μόνο τα επικύνδινα κύτταρα να καταστραφούν.Όμως ενώ η αντίδραση του ανοσοποιητικού συστήματος στα μεταφερόμενα κύτταρα ει΄ναι αρνητικό γεγονός όσον αφορά τη θεραπεία κληρονομικών ασθενειών ,γίνεται πλεονέκτημα στην περίπτωση των κακοηθών όγκων ,γεγονός που συμβάλει στην σμίκρυνσή τους.Τέτοιες αντιδράσεις του ανοσοποιητικού συστήματος είναι η βάση πολλών μεθόδων για την αντιμετώπιση του όγκου.
Ως μέσο μεταφοράς γονιδίων , οι φορείς που προέρχονται από ιούς έχουν θεμελιώδες πλεονέκτημα σε σχέση με μη-υικών μεθόδων , αφού προέρχονται από καλά προσαρμοσμένα «shuttles» γονιδιακών τμημάτων τα οποία έχουν αναπτύξει στρατηγικές για να εκφράσουν αποτελεσματικά τις γονιδιακές πληροφορίες τους στα μολυσμένα κύτταρα.Από την αρχή ,αφοπλισμένα ,ατελούς αντιγραφής σωματίδια ιών ,ικανά για την παράδοση ενός «transgene» σε κύτταρα-στόχους έχουν κερδίσει κεντρικό ρόλο για θεραπευτικούς σκοπούς Επιπλέον ,ιυκοί(από ιό δηλαδή) υποστηρικτές των συστατικών ή διεγέρσιμων εκφράσεων γονιδίων,όπως ο πρώιμος-ενδιάμεσος υποστηρικτής των ανθρώπινων κυτταρομεγαλο-ιών (IC-CMV) ,και ο ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας «long term» επανάληψης(HIV-LTR) καθώς και άλλες υικές λειτουργίες,επιφανειακές γλυκοπρώτείνες όπως όπως G πρωτείνη των ιών κυστικής στοματίτιδας(VSV-G) ή η κινάση θυμιδίνης του ιού του συμπλέγματος του έρπη (HSV-TK) έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετά σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας (ΠΙΝΑΚΑΣ 1).
Όπως εμφανίζεται από αυτή την εισαγωγή , δεν υπάρχει ούτε ένας ιδανικ’ος φορέας ,ούτε μια κοινή στρατηγική που να ισχύει γενικά για όλες τις εφαρμογές, περιτό να πούμε ότι μια κοινή απαίτηση για όλους τους ιικούς φορείς είναι να κατέχουν λειτουργίες οι οποίες να καθιστούν ικανή τη μεταφορά και τη στοχευομένη έκφραση του μεταφερόμενου γονιδίου.
2. Πως να βελτιώσουμε την ικανότητα γενετικής μεταλλαγής των επι του παρόντος χρησιμοποιούμενων φορέων απο ιό.
Η ικανότητα γεννετικής μεταλλαγής μπορεί να οριστεί ως η ικανότητα να προσεγγίζουμε όλα τα κύτταρα-στόχους με θεραπευτικά γονίδια. Αυτό το χαρακτηριστικό εξαρτάται αυστηρά απο τον φορέα που χρησιμοποιείται, απο τη μια πλευρά, και το κύτταρο-στόχο απο την άλλη. Οι ρετροιικοί φορείς έχουν διάφορα χαρακτηριστικά τα οποία τους κάνουν εξαιρετικά ελκυστικούς για την γονιδιακή θεραπεία. Αυτοί ενωποιούν το γονιδίωμα τους μέσα στα χρωμοσώματα των κυττάρων που τα φιλοξενούν, επιτ΄ρεποντας στο θεραπευτικό γονίδιο να διατηρηθεί στους απογόνους για μακροπρόθεσμη έκφραση. Αυτοί μπορούν να μεταλλάξουν γεννετικά τις άνω των 10 kilobases τάξεως, επιτρέποντας έτσι την μεταφορά των σχετικά μεγάλων γονιδίων. Τέλος, αυτοί δεν κωδικοποιούν πρωτείνες ιών οι οποίες μπορούν να προκαλέσουν μία άνοσοαπόκριση προς τα μεταλλαγμένα κύτταρα. Ρετροιικοί φορείς που παράγονται απο ογκορετριούς όπως ο ιος της λευχαιμίας σε τρωκτικό, είναι οι πρώτοι ιοί που χρησιμοποιήθηκαν σε κλινκές δοκιμές και ακόμη και οι πιο δημοφιλείς φορείς για την γονιδιακή θεραπεία. Αυτοί μπορούν να παραχθούν σε μεγάλες ποσότητες απο τυποποιημένες κυτταρικές καλλιέργειες σε ισχύ διαλύματος που κυμαίνεταο απο 105 με 106 cfu/ml (μονάδες σχηματισμού αποικίας ανα χιλιοστό). Αυτοί μπορούν αν συμπυκνωθούν με υπερδιήθηση, εξαχνισμό και να διατηρηθούν για μεγάλες χρονικέ ςπεριόδους είτε σε χαμηλές θερμοκρασίες είτε λυοφιλυμένα. Δύο κύρια μειονεκτήματα των φορέων που βασίζονται σε MLV είναι η αδυναμία τους να μεταλλάξουν τα μη διαιρούμενα κύτταρα και η ευαισθησία τους στο ανθρώπινο συμπλήρωμα. Και τα δύο αυτά χαρακτηριστικά περιορίζουν την εφαρμογή αυτών των φορέων για άμεση μετάλλαξη in vivo, εκτός και άν η χρήση τους είναι προβλέψιμησε περιορισμένα ανοσο-προνομιούχα τμ΄ήματα και μόνο για τα διαιρέσιμα κύτταρα. Επομένως, μια απο τις πιο ελπιδοφόρες άμεση εφαρμογή MLV φορέων in vivo είναι η θεραπεία όγκων εγκεφάλου. Σε αυτή την περίπτωση αποτελεσματική μετάλλαξη και σωστή στόχευση των ογκορετροικών φορέων εξασφαλίζεται και με διαίρεση κυττάρου του όγκου στο γενικό πλάισιο ενός ιστού που είναι αδιαίρετος εξ ορισμού, και απουσίας λύσης συμπληρωματικού ενδιάμεσου των εξωκυτταρικών μορφών ιών. Άλλες εφαρμογές αυτών των φορ΄’εων εντοπίζονται σε ex vivo πρωτόκολλα στα οποία τα κύτταρα στόχοι μεταλλάσονται υπο άριστες συνθήκες καλλέργειας, πριν τη μεταφορά τους στον ασθενή. Τέτοια πρωτόκολλα σχεδιάστηκαν αρχικά για να μεταλλάσουν τα Τ-λεμφοκύτταρα ασθενών με ADA ανεπάρκεια, λεμφοκύτταρα φιλτροποίησης όγκων, πριν απο την προσαρμοζόμενη τους μεταφορά, ηπατοκύτταρα απο ασθενείς με οικογενειακή υπερχοληστερολαιμία και ανεπτυγμένα κύτταρα όγκων για αντικαρκινικό εμβολιασμό.
Μέχρι στιγμής έχουμε περιγράψει εφαρμογές των φορέων που βασιζονται στούς MLV , καθώς αυτοί προς το παρόν παράγονται , όμως στρατηγικές ακολουθούνται για να ξεπερασουν τους περιορισμούς τους , ώστε να αυξηθεί το πεδίο εφαρμογής τους.
Ενδιάμεση-συμπληρωματική λύση , μή ανθρώπινων ογκορετροιικών φορέων στον ανθρώπινο ορο εξαρτάται από την κυτταρική γραμμή που χρησημοποιείται για την παραγωγή εξωκυτταρικών σχηματισμών ιών και τους ανώτερους περιβληματικούς καθοριστές. Οι τυποποιημένες γραμμές παραγωγής που χρησημοποιούνται κατά κόρον για την δημιουργία αυτ΄βν των φορέων κατάγονται από το τροκτικό mus, όπως PA317, ΑΜ-12 ή CRIP, και παράγουν εκωκυτταρικές φόρμες ιών, οι οποίες είναι συμβατές με τον ανθρώπινο ορό. Νέες γραμμές παραγωγής που παράγονται από ανθρώπινα κύτταρα είναι τόρα διαθέσιμα και ικανά να παράγουν χωρίς βοηθητικά, ρετροιικούς φορείς, ανθεκτικούς σε ανθρώπινα συμπληρώμεατα σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Τέτοιοι εξωκυτταρικοί σχηματισμοί ανθεκτικοί σε ανθρώπινα συμπληρώματα πρέπει να διατηρούν την ακεραιότητά τους in vivo, επιτρέποντας σε ένα μεγαλύτερο αριθμό ενεργών φορέων να φτάσουν στουν ιστό στ’οχο. Η ανικανότητα των ρετοιικών φορέων να αναπλάσει γενετικά μη διαιρούμενα κύτταρα περιορίζει τη χρήση του για στόχευση εγκεφάλου, πνεύμονα ή σικωτιού. Όλα τα μέλη της υποοικογένειας Oncovirinae που μελετήθηκαν μέχρι στιχμής παρουσιάζουν αυτό το χαρακτηριστικό. Οι Lentiviruses και Spumaviruses έχει αποδειχτεί ότι μολύνουν και διαιρούμενα και μη διαιρούμενα κύτταρα. Το γνωστότερο μέλος της υποοικογένειας των Lentivirinae είναι ο ιός της ανθρωπινης ανοσοεπάρκειας τύπου Ι (ΗIV I), ο οποίος έχει χρησημοποιηθεί για την ανάπτυξη φορέων για in vivo παράδοση γονιδίων σε μη διαιρούμενα κύτταρα. Για μολύνουν τέτοιοι φορείς ένα μεγαλύτερο φάσμα κυττάρων το env γονίδιο αντικαθίσταται από env γονίδια άλλων ιών, όπως το γονίδιο γλυκοπρωτείνης G, ιών κυστικής στοματίτιδας. Φορείς-Lentivirus έχουν χρησημοποιηθεί επιτυχώς σε ανάπλαση εγκεφαλικών, μυικών κυττάρων, κυττάρων σικωτιού και αμφιβλιστροείδούς χιτώνα ματιού, τρωκτικών, με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα συγκρινόμενη με τους φορείς που βασιζονται σε MLV. Φορείς-Lentivirus αραιώνονται με απομάκρυνση ιικών γονιδίων (env, vif, vpr, vpu, nef), από τυποποιημένα πλασμίδια, έχουν αναπτυχθεί με ένα πολύ υψηλότερο βαθμό βιοασφάλειας. Οι HIV βασισμένοι φορείς είναι ανθρώπινοι ιοί που προσορινά παράγονται σε ανθρώπινες κυτταρικές διεργασίες, ενδογενώς ανθεκτικά στη λύση ενδιάμεσων ανθρώπινων συμπληρωματικών. Μικρής κλίμακας παραγωγή φορέων-Lentiviral έχει αποδόσει συγκεντρώσεις διαλύματος συγκρίσιμες με αυτές που λαμβάνονται με ογκορετροιικούς φορείς, κάνοντας τους πιθανούς υποφήφιους για συγκεκριμένες εφαρμογές.
Η μόνη πραγματική εναλλακτική λύση στη χρήση ογκοανασταλτικών φορέων που έχει πάρει έγκριση για κλινική χρήση είναι η χρήση αδενοϊικών φορέων (Adenoviral vectors) (Αd) . Η πρώτη γενιά αδενοϊικών φορέων προέκυψε από αντικατάσταση των γονιδίων Ε1Α και Ε1Β με το προς μεταφορά γονίδιο και τη διαγραφή του γονιδίου Ε3 . Οι παραγόμενοι αδενοϊικοι φορείς , μπορούν με λυοφιλοποίηση να αποθηκευτούν και να χρησιμοποιηθούν μετά από μεγάλες χρονικές περιόδους . Τέτοιοι φορείς μπορούν να προσβάλουν τόσο διαιρούμενα όσο και μη διαιρούμενα κύτταρα , με αποτέλεσμα μεγαλύτερα ποσοστά ανάπλασης (transduction) in vivo από ότι οι αντίστοιχοι ιικοί φορείς (retroviral vectors) . Δυστυχώς , τα αποτελέσματα της έκφρασης της ανάπλασης σε ένα ανοσοανταγωνιστικό δέκτη in vivo είναι βραχυπρόθεσμα . Ένα μεγάλο μειονέκτημα των αδενοϊικών φορέων πρώτης γενιάς είναι το γεγονός ότι οι περισσότερες ιικές πρωτεΐνες εκφράζονται από τα αναπλασμένα κύτταρα . Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα μια ισχυρή ανοσοποιητική κινητοποίηση από τη πλευρά του δέκτη , με κατεύθυνση τα αναπλασμένα κύτταρα . Η δεύτερη γενιά αδενοϊικών φορέων προέκυψε από αντικατάσταση άλλων ιικών γονιδίων , όπως των Ε2Α και Ε4 με αποτέλεσμα την επαναρύθμιση της ιικής γονιδιακής έκφρασης από το φορέα και τη παροχή των προς μεταφορά λειτουργιών στα κατάλληλα κύτταρα . Πρόσφατα αναπτύχθηκαν αδενοϊικοί φορείς που στερούνταν όλα τα ιικά γονίδια (gutless vectors) , με μεγάλη βελτίωση της έκφρασης των μεταφερόμενων γονιδίων in vivo . Παρόλα αυτά , η χρήση των αδενοϊικών φορέων μέχρι σήμερα δεν έχει θεαματικά αποτελέσματα , κυρίως λόγω της αδυναμίας των φορέων αυτών να συγχωνευτούν με το κυτταρικό γονιδίομα .
Η ιδέα του συνδυασμού της ικανότητας συγχώνευσης με το κυτταρικό γονιδίομα των ιικών φορέων και της υψηλής ικανότητας ανάπλασης των αδενοϊικών φορέων διατυπώθηκε με βάση πειραματικά δεδομένα . Σύμφωνα με τη προσέγγιση αυτή , ο αδενοϊός παίζει το ρόλο μεταφορέα στις in vivo μετακινήσεις πληροφοριών , καθιστώντας το κύτταρο ικανό να μεταφέρει το ιικό φορέα στα γειτονικά του κύτταρα και επιτρέποντας τη μόνιμη ανάπλασή τους .
3. ΒΕΛΤΙΩΝΟΝΤΑΣ ΤΗΝ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΠΡΟΣΒΟΛΗΣ ΤΟΥ ΦΟΡΕΑ
Κάποιοι ιοί , όπως οι MLV και Ad έχουν ευρύ φάσμα προσβολής όσον αφορά τα κύτταρα στόχους και χρησιμοποιούνται για ex vivo εφαρμογές ή για την απευθείας προσβολή του προς θεραπεία ιστού . In vivo αναπλάσεις λεμφοκυττάρων , αιμοποιητικών και άλλων «ανασχετικών» κυττάρων , αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων και κακοηθών κυττάρων, απαιτεί την ανάπτυξη φορέων που μπορούν εκλεκτικά να προσκολλούνται στο προκαθορισμένο κύτταρο-στόχο . Τέτοιοι φορείς υψηλής εκλεκτικότητας μπορούν να προκύψουν με δύο τρόπους :
- Με εκλεκτική επιτάχυνση του σταδίου της προσβολής
- Ρυθμίζοντας την έκφραση του θεραπευτικού γονιδίου στο στάδιο της αντιγραφής μέσο εξειδικευμένων προβιβαστών.
3.1 ΑΝΑΣΧΗΜΑΤΙΖΟΝΤΑΣ ΤΟ ΠΕΡΙΒΛΗΜΑ ΤΟΥ ΦΟΡΕΑ
Η εξασφάλιση της έκφρασης του μεταφερόμενου γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρου μπορεί να γίνει με τη μετατροπή του ιικού περιβλήματος . Η πρόσδεση του ιού στη κυτταρική μεμβράνη απαιτεί την ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτείνης περιβλήματος (Env) , που εμφανίζεται στην επιφάνεια του ιού και ενός υποδοχέα που βρίσκεται στην επιφάνεια του κυττάρου φορέα . Το γεγονός αυτό επιτρέπει το πέρασμα του ιού γενετικού υλικού μέσα από τη κυτταρική μεμβράνη προς το κυτταρόπλασμα του προσβεβλημένου κυττάρου. Ιοί των οποίων οι πρωτείνες του περιβλήματος που είχαν υποστεί ειδική επεξεργασία ώστε να εμφανίσουν πρόσθετους εξειδικευμένους υποδοχείς και σημεία σύνδεσης με κύτταρα στόχους , π.χ παράγοντες αντισωμάτων , ήταν οι πρώτοι που επιτυχώς χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή της πρωτεΐνης περιβλήματος του ιού της λευχαιμίας MLV-Ε .
Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα πρόσδεσης ιού – κυττάρου
είναι η πρόσδεση ενός βακτηριοφάγου στα τοιχώματα ενός βα-
κτηριακού κυττάρου .
Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επαφή μεταξύ ιού και κυττάρου είναι αναγκαία και όχι ικανή συνθήκη για την προσβολή του κυττάρου – στόχου και ότι η τροποποίηση των πρωτεϊνών μπορεί να αποδώσει στον φορέα δραστικότητα που δεν διέθετε προηγουμένως. Για παράδειγμα αναφέρουμε ότι η απόδοση ενός υποδοχέα σε κάποιο ιικό περίβλημα μπορεί να επιτρέψει στον ιό αυτό να προσβάλλει ανθρώπινα κύτταρα που επίσης εκφράζουν τον υποδοχέα αυτόν . Τέλος από πειραματικά δεδομένα προκύπτει ότι η τροποποίηση του περιβλήματος μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της αναπλαστικής ικανότητας του ιικού φορέα , με αποτέλεσμα ναι μεν να έχουμε την επιθυμητή εκλεκτικότητα αλλά ταυτόχρονα και μείωση στην ικανότητα ανάπλασης των κυττάρων στόχων . Αυτό συμβαίνει γιατί η τροποποίηση των πρωτεϊνών του περιβλήματος του ιού δημιουργεί ανενεργές περιοχές που δρουν παρεμποδιστικά στη δράση προσβολής του κυττάρου στόχου . Το πρόβλημα μπορεί να λυθεί με τη χρήση ενεργοποιημένων φορέων πρωτεασών (protease activable vectors) που επιτρέπουν μια νέα στρατηγική δύο βημάτων : Ένας εκλεκτικός ιικός φορέας με τροποποιημένο περίβλημα συνδέεται με το κύτταρο στόχο (πρώτο βήμα) και ανοίγεται δρόμος στην ανενεργή περιοχή της μεμβράνης του με την χρήση ειδικών πρωτεασών (δεύτερο βήμα) , γεγονός που επιτρέπει στον ιό να συνεχίσει και να προσβάλει το κύτταρο. Μόλις η ανενεργός περιοχή καθαριστεί από την πρωτεάση, η προσβολή ακολουθεί το φυσιολογικό μηχανισμό επιτρέποντας έτσι τη μεγιστοποίηση της απόδοσης της δράσης . Η τεχνική αυτή έχει αποδειχτεί ότι είναι πραγματοποιήσιμη . Ο συνδυασμός τροποποιημένου περιβλήματος – πρωτεασών ,για να αποκτήσει κλινικές εφαρμογές , απαιτεί τον εντοπισμό των κατάλληλων πρωτεασών , που καταστρέφουν την ανενεργή περιοχή σύνδεσης αμέσως μετά την επαφή του ιού με το κύτταρο στόχο.
3.2 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ του θεραπευτικού γονιδίου στο στάδιο της metaγραφής
Οι περισσότερες πληροφορίες που συγκεντρώνονται πάνω στη ρύθμιση της έκφρασης του θεραπευτικού γονιδίου στο στάδιο της αντιγραφής αφορούν κυρίως μηχανισμούς αντιμετώπισης καρκινικών κυττάρων . Αυτό είναι αποτέλεσμα του μεγάλου ενδιαφέροντος της εφαρμογής της γονιδιακής θεραπείας για τη θεραπείας του καρκίνου και υπογραμμίζει την αναγκαιότητα του περιορισμού των τοξικών θεραπειών πάνω στα κακοήθη κύτταρα .Ο έλεγχος της αντιγραφής μπορεί να επιτευχθεί με χρήση ιστοεξειδικευμένων cis- ενεργών ακολουθιών .Μερικά in vitro αποτελέσματα πειραμάτων έχουν αποδείξει ότι η μέθοδος λειτουργεί ως προς την αρχή της , αλλά τα αποτελέσματα δεν είναι αρκετά θεαματικά για να λειτουργήσει σε κλινικό στάδιο.
Μερικοί κυτταρικοί προβιβαστές διατηρούν την επιθυμητή εκλεκτικότητα όταν τοποθετούνται σε ιικούς φορείς . Παρόλα αυτά δεν είναι σπάνιο το φαινόμενο όπου κυτταρικές cis ενεργές ακολουθίες , σαν περιεχόμενο ιικών φορέων , χάνουν μέρος , αν όχι όλες, τις δυνατότητες περιορισμού της έκφρασης του ανεπιθύμητου γονιδίου . Το πρόβλημα μπορεί να αντιμετωπιστεί με χρήση φορέων που προέρχονται από ιούς που παρουσιάζουν ενδογενή μεταγραφική προτίμηση για το κύτταρο – στόχο. Εναλλακτικά με τη μέθοδο αυτή μπορεί να αντικατασταθεί το σύμπλεγμα των προβιβαστών του ιού με ιστοεξειδικευμένες ακολουθίες ώστε να δημιουργηθεί μια μονάδα ικανή να μεταγραφεί (transcriptional) σε ορισμένους μόνο ιστούς . Ο ανθρώπινος μικροϊός (parvovirus) B19 για παράδειγμα , είναι εξειδικευμένος για να προσβάλλει τα ερυθρά αιμοσφαίρια .
Η χρησιμότητα ιικών φορέων με αντικατεστημένες ακολουθίες προβιβαστών γίνεται αντιληπτή στη περίπτωση των MLV , τη μεταγραφική δυνατότητα των οποίών περιορίζουν σε σημαντικό βαθμό , όπως προκύπτει από πειραματικά δεδομένα .
Υποθέτοντας ότι οι προβιβαστές είναι υπεύθυνοι για το μεταγραφικό τροπισμό των ιών , διατυπώθηκε η άποψη ότι αντικαθιστώντας τους με ακολουθίες που απαιτούν την ύπαρξη ιστοπεριοριστικών μεταγραφικών παραγόντων για να δράσουν , θα προέκυπτε ιός με ιστοπεριοριστική δραστηριότητα , αλλά τα πειραματικά αποτελέσματα της εφαρμογής της ιδέας αυτής δεν έδειξαν in vitro ενθαρρυντικά αποτελέσματα .
Τέλος σε μία τρίτη μελέτη , μέρος του U3 γονιδίου ενός MLV-LTR ιού αντικαταστάθηκε από ένα υβρίδιο ρυθμιστικού παράγοντα αποτελούμενο από CMV και HIV TAR παράγοντες . Παρατηρήθηκε ότι η έκφραση του LTR αυξάνεται με την ταυτόχρονη παρουσία της HIV TAR πρωτεΐνης . Τέτοιοι φορείς είναι πολλά υποσχόμενοι στα πλαίσια της αντιβιοτικής γονιδιακής θεραπείας.
4. Πως να αποφύγουμε την απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος.
Στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος είναι να αναγνωρίζει και να καταστρέφει τα ξένα αντιγόνα. Αναμένεται λοιπόν η εισαγωγή και έκφραση ξένου γενετικού υλικού σε ανθρώπινα κύτταρα in vivo να προκαλέσει μια αντίδραση του ανοσοποιητικού συστήματος, η οποία καλείται ανοσοαπόκριση. H ανοσοαπόκριση διακρίνεται σε δυο κατηγορίες, ανάλογα με τη φύση της, στην ανοσοαπόκριση με τη μεσολάβηση κυττάρων και την ανοσοαπόκριση με τη μεσολάβηση εξειδικευμένων πρωτεϊνών, οι οποίες καλούνται αντισώματα. Στην πρώτη περίπτωση εξειδικευμένα κύτταρα (τα Τ λεμφοκύτταρα) αντιδρούν με τα ξένα αντιγόνα που βρίσκονται στην επιφάνεια άλλων κυττάρων του οργανισμού και τα καταστρέφουν. Τα Τ λεμφοκύτταρα διακρίνονται σε Τ κύτταρα αρωγούς, των οποίων ρόλος είναι να επισημαίνουν τα μολυσμένα κύτταρα αναγνωρίζοντας τα διαφορετικά αντιγόνα ιστοσυμβατότητας της επιφάνειας τους και σε κυτταροτοξικά Τ κύτταρα, των οποίων ρόλος είναι να καταστρέφουν τα μολυσμένα κύτταρα. η αναγνώριση των ομοίων κυττάρων ή των ξένων κυττάρων από έναν οργανισμό συντελείται από μια ομάδα μοναδικών πρωτεϊνών στην επιφάνεια των περισσότερων κυττάρων του. Οι πρωτείνες αυτές καλούνται αντιγόνα ιστοσυμβατότητας (MHC) και διακρίνονται σε δυο κλάσεις, την κλάση Ι και την κλάση ΙΙ. Τα αντιγόνα της κλάσης Ι απαντούν σε όλα τα κύτταρα ενός οργανισμού, εκτός από αυτά του ανοσοποιητικού συστήματος, ενώ οι πρωτεΐνες της κλάσης ΙΙ απαντώνται μόνο στα λεμφοκύτταρα.
Στην πράξη παρατηρείται έντονη ανοσοαπόκριση όταν οι φορείς που χρησιμοποιούνται είναι αδενοιοί, η in vivo διαχείριση των οποίων προκαλεί ανοσοαπόκριση τόσο με μεσολάβηση κυττάρων, όσο και με μεσολάβηση αντισωμάτων. Η εισαγωγή ιών (at high titre) προκαλεί ανοσοαπόκριση με μεσολάβηση αντισωμάτων, ως προς τα αντιγόνα του περιβλήματος του ιού, με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της περαιτέρω διαχείρισης του ιού-φορέα. Αξίζει να αναφέρουμε ότι ένα μεγάλο ποσοστό του ανθρώπινου πληθυσμού παρουσιάζει ανοχή στη μεταφορά γονιδίων με φορείς τους αδενοιούς, έχοντας αποκτήσει μια ανοσολογική μνήμη από παλιότερες υποκλινικές μολύνσεις από αδενοιούς (wild-type). Τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ανασυνδυασμένους αδενοιούς-φορείς καταστρέφονται από τα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα, τα οποία αναγνωρίζουν τα αντιγόνα των ιών. Αυτές οι ανοσοαποκρίσεις προκαλούνται όχι μόνο από τις πρωτείνες των ιών που εκφράζονται από τα μολυσμένα κύτταρα, αλλά και από τα προϊόντα του μεταφερόμενου γονιδίου, τα τελευταία αναγνωρίζονται ως ξένο σώμα σε σχέση με τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας κλάσης Ι (ΜΗC Ι) της επιφάνειας των κυττάρων και στη συνέχεια καταστρέφονται. Η χρήση ρετροιών ως φορείς γονιδίων δεν προκαλεί τόσο έντονη ανοσοαπόκριση με μεσολάβηση αντισωμάτων, όσο κατά την in vivo διαχείριση των αδενοιών. Αυτό ίσως οφείλεται στην σε διάφορους λόγους, όπως η επίτευξη γενικά χαμηλότερων titre, η μεσολάβηση του συμπληρώματος (ομάδα 20 περίπου πρωτεϊνών που κυκλοφορούν στο αίμα και στα άλλα εξωκυττάρια υγρά και δρα είτε δεσμευμένο στους πολυσακχαρίτες της επιφάνειας των βακτηρίων, είτε σε συνεργασία με τα αντισώματα) για τη λύση των ρετροιών και η έλλειψη έκφρασης ιικών αντιγόνων. Παρόλα αυτά, μια κυτταρική ανοσοαπόκριση έχει παρατηρηθεί σε Τ-λεμφοκύτταρα, στα οποία έγινε ex vivo μεταφορά γονιδίου με φορέα τον MLV ρετροιό, μετά από επανεισαγωγή στον ασθενή.
Για την εξεύρεση λύσης στο πρόβλημα της ανοσοαπόκρισης κατά των ιών φορέων, θα πρέπει να μελετηθεί ο τρόπος με τον οποίο κάποιοι ιοί ξεφεύγουν από το ανοσοποιητικό σύστημα. Η Ε3 περιοχή των αδενοιών, για παράδειγμα, έχει δειχτεί ότι κωδικοποιεί διάφορα γονίδια, τα οποία έχουν την ικανότητα να διαμορφώνουν την ανοσοαπόκριση, ως προς τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με αδενοιό. Μια 19-kDa γλυκοπρωτεΐνη (gp 19k) είναι γνωστό ότι αναστέλλει την εμφάνιση αντιγόνων σε σχέση με τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας κλάσης Ι (MHC I) δυσχεραίνοντας τόσο την αναγνώριση των πεπτιδίων, όσο και την καταστροφή των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από αδενοιούς, από τα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα. Μια 14,7 kDa πρωτεΐνη και το σύμπλεγμα δύο 10,4 και 14,5 kDa πρωτεϊνών έχει αποδειχτεί ότι ελέγχουν τον παράγοντα νέκρωσης όγκων, όπου μεσολαβεί κυτταρόλυση των μολυσμένων κυττάρων. Ο συνυπολογισμός της Ε3 περιοχής που προκαλείται από ένα δομικό προαγωγέα σε ένα αδενοιό-φορέα έδειξε ότι εμποδίζει την αναμενόμενη κυτταρική και αντισωματική ανοσοαπόκριση, επιτρέποντας την ασφαλή και μακροπρόθεσμη έκφραση του μεταφερόμενου γονιδίου. Για τη μελέτη μόνο της κυτταρικής ανοσοαπόκρισης θα ήταν καλύτερο να ελαχιστοποιηθεί η εμφάνιση αντιγόνων σε σχέση με τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας κλάσης Ι (MHC I), χρησιμοποιώντας ένα απλό γονιδιακό προϊόν. Για παράδειγμα η γλυκοπρωτεΐνη των αδενοιών (gp 19k) χρησιμοποιήθηκε μόνη της σε ένα φορέα αδενοιού για την αναστολή της μεταφοράς μορίων MHC I στην επιφάνεια των κυττάρων. Άλλες λειτουργίες των ιών που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα, μπορούν να εφαρμοστούν στην γονιδιακή θεραπεία. Η πρωτείνη ICP 47 του ιού του έρπη (simplex) αναστέλλει την εμφάνιση αντιγόνων στους CD8+ υποδοχείς των Τ-λεμφοκυττάρων μπλοκάροντας τον μεταφορέα των πεπτιδίων που συνδέεται με τη διαδικασία αντιγόνων. Τα γονιδιακά προϊόντα US2,US3,US11 και US6, καθώς και η pp65 πρωτείνη του περιβλήματος των ανθρώπινων κυτταρομεγαλοιών (HCMV) απαιτούνται για την ανοχή του ανοσοποιητικού συστήματος σε HCMV μολυσμένα κύτταρα. Τα US2 και US11 προκαλούν ελάττωση της επιφάνειας των MHC I με αποτέλεσμα την γρήγορη εκτόπιση των μορίων κλάσης Ι από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕR) στο κυτταρόπλασμα, όπου δεν μπορούν να φορτώσουν πεπτίδια αντιγόνων και εκφυλίζονται. Το US3 προκαλεί συσσώρευση των αντιγόνων ιστοσυμβατότητας στο ενδοπλασματικό δίκτυο, εμποδίζοντας τη μεταφορά των αντιγόνων ιστοσυμβατότητας στην κυτταρική επιφάνεια. Η pp65, επειδή παρουσιάζει εσωτερική φωσφορυλιωτική δραστικότητα, μπλοκάρει επιλεκτικά τη δράση των αντιγόνων και την εμφάνιση των γονιδιακών προϊόντων των ανθρώπινων κυτταρομεγαλοιών. Η US6 γλυκοπρωτεΐνη, από την άλλη, προσδένεται στον μεταφορέα των πεπτιδίων και αναστέλλει τη μετακίνηση των πεπτιδίων. Κάποιες από αυτές τις λειτουργίες έχουν αναπτυχθεί φυσικά για να βοηθούν τους ιούς να αποφεύγουν την ανοσοαπόκριση και είναι δυνατό να μεταφερθούν στους ιούς φορείς, ώστε να εμποδίζουν την αναγνώριση από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα και την λύση των μεταλλαγμένων κυττάρων.
5. Προοπτικές της γονιδιακής θεραπείας στον 21ο αιώνα
παρά την αλματώδη ανάπτυξή της, η γονιδιακή θεραπεία δεν έχει εκπληρώσει ακόμα τις υποσχέσεις της. Είναι δύσκολο να πούμε πόσοι από τους περίπου 3000 ασθενείς σε όλο τον κόσμο που υποβλήθηκαν σε σχεδόν 300 κλινικές δοκιμές, πραγματικά ωφελήθηκαν από τη γονιδιακή θεραπεία. περιστατικά κλινικών προόδων έχουν διαπιστωθεί μόνο για έναν ADA ασθενή, δύο ασθενείς με κληρονομική υπερχολεστερολαιμία και δυο ασθενείς με αναιμία Fanconi.
Τα τελευταία δέκα χρόνια υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για χρήση της γονιδιακής θεραπείας σε κληρονομικές ασθένειες, αλλά και σε επίκτητες ασθένειες με ένα γονιδιακό συστατικό, όπως ο καρκίνος και το AIDS. Γι αυτό, η γονιδιακή θεραπεία απαιτείται να έχει ένα πιο πολύπλοκο ρόλο από την απλή αντικατάσταση ή καταστολή γονιδίων. Για παράδειγμα, προτείνονται επί του παρόντος κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία όγκων στον εγκέφαλο, που βασίζονται στην επίδραση των παρευρισκομένων ενεργών ενζύμων TK σε συνδυασμό με κυτταροκίνες, όπως την IL-2 (Οι κυτταροκίνες είναι πεπτίδια ή πρωτεΐνες που παράγονται από κύτταρα που δεν ανήκουν στα κύτταρα του αίματος και συμμετέχουν κυρίως στις τοπικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαφόρων κυττάρων χωρίς όμως να δεσμεύουν αντιγόνα). Επίσης, είναι δυνατή η πρόβλεψη μιας επιτυχημένης θεραπείας του AIDS, που βασίζεται στην επανέγχυση γενετικά τροποποιημένων, με πολλά αντιγόνα, αυτόλογα Τ αρωγούς λεμφοκύτταρα, ανθεκτικά στον HIV και ικανά να ελέγχουν επιλεγμένες μολύνσεις, συμπεριλαμβανομένου και του ίδιου του HIV.
Το κύριο πραγματικό εμπόδιο για την εξέλιξη της γονιδιακής θεραπείας ως ένα ισχυρό θεραπευτικό εργαλείο, παραμένει η επιθυμητή και μακροπρόθεσμη ρυθμιστική έκφραση του μεταφερόμενου γονιδίου. Κάποιες επιδιορθώσεις που παρουσιάζονται στο παρακάτω σχήμα ίσως βοηθήσουν να ξεπεραστούν αυτά τα εμπόδια.
- Σχεδιασμός υβριδικών δομών όπου συμμετέχουν πεπτίδια ιών και μη ιών, που επιλέγουν τα κύτταρα στόχους και βοηθούν στη σύντηξη.
- Χρήση αλληλουχιών (cis acting), που παρακινούν την κυτταροειδική και ιστοειδική γονιδιακή έκφραση.
- Υιοθέτηση μεθόδων αποφυγής αναγνώρισης από το ανοσοποιητικό σύστημα.
- Βιοτεχνολογικοί πρόοδοι που επιτρέπουν μεγάλης κλίμακας παραγωγή φορέων με ένα βελτιωμένο δείκτη βιοασφάλειας.
Οι περισσότερες ασθένειες του ανθρώπου, όπως ο καρκίνος, μολύνσεις ιών, εκφυλιστικές διαταραχές καθώς και οι κληρονομικές έχουν αποκτήσει γενετικά στοιχεία που παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεσή τους. Μπορούμε να περιμένουμε ότι στο προσεχές μέλλον, προσεκτική ρύθμιση των φορέων και των συστημάτων μεταφοράς, σύμφωνα με τους μηχανισμούς παθογένεσης των ασθενειών, θα εξασφαλίσουν στα κατάλληλα θεραπευτικά γονίδια μια καλύτερη προοπτική να κάνουν τις ασθένειες αυτές θεραπεύσιμες.
Κατεβάστε την εργασία εδώ
